Detail hesla - Poruchy respiračního řetězce - diagnostika

Poruchy respiračního řetězce - diagnostika



Slovníková definice
není k dispozici

Plná definice
Diagnostické testy

Screeningové testy

Screeningové testy zahrnují stanovení laktátu, pyruvátu, ketolátek a jejich molárních poměrů v plazmě, jako indikátorů redox stavu v cytoplazmě a mitochondriích. Stanovení by měla být provedena během dne před a jednu hodinu po jídlech. Současně by měly být monitorovány hladiny glukózy a neesterifikovaných mastných kyselin. Nález trvalé hyperlaktacidémie (> 2,5 mmol/l) se zvýšeným molárním poměrem L/P a ketolátek (zvláště po jídle) je vysoce podezřelý z deficitu respiračního řetězce. Vyšetření redox stavu může navíc pomoci rozlišit různé příčiny vrozené laktátové acidózy na základě molárních poměrů L/P a ketolátek in vivo. Poruchy oxidativní fosforylace obvykle vedou ke zvýšení poměrů L/P nad 20 a poměrů ketolátek nad 2, zatímco porucha pyruvátdehydrogenázového komplexu (PDHC) vede ke snížení poměru L/P (< 10). I když je málo známo o poruchách cyklu trikarboxylových kyselin, zdá se, že také tyto poruchy vedou k vysokým poměrům L/P, ale molární poměry ketolátek jsou u těchto poruch nižší (< 1) než u poruch respiračního řetězce (rovněž u deficitu pyruvátkarboxylázy).

Tyto diagnostické testy však mohou při diagnostice poruch redox stavu v plazmě selhat.

Úskalí metabolického screeningu jsou následující:

  • Hyperlaktacidémie může být latentní za bazálních podmínek a může být odhalena pouze zátěžovým testem s glukózou (2 g/kg per os) nebo určením redox stavu v likvoru. Měření hladiny laktátu v likvoru nemá smysl, je-li redox stav v plazmě porušen.
  • Proximální tubulopatie může snížit hladinu laktátu v krvi a zvýšit vylučování laktátu v moči. V tomto případě může plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie detekovat v moči laktát a intermediáty cyklu kyseliny citrónové.
  • Diabetes mellitus může bránit vstupu pyruvátu do cyklu kyseliny citronové.
  • Tkáňově specifické izoformy mohou být postiženy selektivně a minimálně měnit redox stav v plazmě (to může platit zvláště pro hypertrofické kardiomyopatie).
  • Porucha může být generalizovaná, ale parciální. Čím více takových tkání s vyšší závislostí na oxidativním metabolismu je postiženo (jako mozek a svaly), tím více je postižen redox stav v plazmě.
  • Porucha může být omezena na komplex II, minimálně alterující (v principu) redox stav v plazmě.

Jsou-li diagnostické testy negativní, může být diagnóza deficitu respiračního řetězce opominuta, zvláště tehdy, je-li přítomen pouze jeden symptom. Naopak se snáze zvažuje, jsou-li pozorovány zdánlivě nepříbuzné symptomy. Z tohoto důvodu zahrnuje vyšetření rizikových pacientů (ať je úvodní symptom jakýkoliv) systematický screening postižení všech orgánů, neboť mnohočetné postižení orgánů je důležitým vodítkem pro diagnostiku.

Enzymatická vyšetření

Zjištění patologického redox stavu v plazmě a/nebo průkaz mnohočetného postižení orgánů jsou důvodem k provedení enzymatických vyšetření. Tato vyšetření zahrnují dva zcela odlišné diagnostické postupy, které poskytují nezávislá vodítka pro deficity respiračního řetězce: polarografické studie a spektrofotometrické studie.

Polarografické studie spočívají v měření spotřeby kyslíku ve frakcích bohatých na mitochondrie Clarkovou elektrodou v přítomnosti různých oxidativních substrátů (malát s pyruvátem, malát s glutamátem, sukcinát, palmitát atd.).

V případě deficitu komplexu I prokáží polarografické studie poruchu respirace s NADH-produkujícími substráty, zatímco respirace a fosforylace jsou normální s FADH-produkujícími substráty (sukcinát).

Opačný nález je v případech s deficitem komplexu II , zatímco blok na úrovni komplexu III a IV poškozuje oxidaci NADH- i FADH-produkujících substrátů.

U deficitu komplexu V je porušena respirace s různými substráty, ale přidáním 2,4-dinitrofenolu nebo kalciových iontů se respirační poměr vrací k normálu, což vede k názoru, že limitující krok je součástí spíše fosforylace než respiračního řetězce.

Je dobré si pamatovat, že polarografické studie nedetekují pouze poruchy oxidativní fosforylace, ale také deficit PDH, enzymatické deficity cyklu kyseliny citronové a genetické poruchy přenašečů, kyvadlových přenašečů a substrátů (včetně cytochromu c, kationtů a adenylátu), neboť také u těchto poruch je porucha tvorby redukčních ekvivalentů v mitochondrii. V těchto případech jsou však aktivity respiračních enzymů normální.

Zatímco dřívější techniky vyžadovaly gramová množství svalové tkáně, nynější metody umožňují rychlou separaci frakcí bohatých na mitochondrie z malé biopsie kosterních svalů (100 - 200 mg, získaných v lokální anestezii), což činí polarografii dostupnou pro kojence a děti. Dostupné jsou také polarografické studie v intaktních cirkulujících lymfocytech (izolované z 10 ml krve na Percollu) nebo detergentnem permeabilizovaných kultivovaných buňkách (lymfoblastoidní buněčné linie, kožní fibroblasty) a představují méně invazivní a snadno reprodukovatelný diagnostický test. Jediným omezením těchto technik je absolutní požadavek na čerstvý materiál: v zamraženém materiálu nejsou polarografické studie možné.

Spektrofotometrické studie zahrnují měření aktivit respiračních enzymů, odděleně nebo ve skupinách, s použitím specifických elektronových akceptorů a donorů. Nevyžadují izolaci mitochondriálních frakcí a mohou být provedeny v homogenátech tkání. Z tohoto důvodu je množství materiálu potřebného pro enzymatické vyšetření velmi malé a může být snadno získáno jehlovou biopsií jater a ledvin a dokonce endomyokardiálních biopsií. Podobně 25 ml láhev s kultivovanými kožními fibroblasty nebo peleta lymfocytů získaná z 10 ml vzorku krve jsou dostatečné pro rozsáhlé spektrofotometrické studie. Vzorky by měly být ihned zamraženy a uchovávány v tekutém dusíku (nebo při -80 °C).

Zvláštní pozornost by měla být věnována zřejmě paradoxním případům, kde respirační enzymatické aktivity jsou jednotlivě normální, ale jsou deficitní, jsou-li měřeny ve skupinách (I - III, II - III, III - V), neboť to jsou možné případy deficitu koenzymu Q10 (CoQ10), potenciálně léčitelné choroby, způsobené dědičnou poruchou syntézy chinonu. CoQ10 hraje rozhodující roli v mitochondriálním respiračním řetězci. Rozděluje elektrony mezi různými dehydrogenázami a cytochromovými částmi respiračního řetězce. Ve srovnání s ostatními částmi respiračního řetězce ho je velký nadbytek a tvoří ohraničený pool, jehož redox stav jemně reguluje aktivitu dehydrogenáz.

Rozhodující průkaz deficitu respiračního řetězce je dán enzymatickým vyšetřením, proto by měla být zvláštní pozornost věnována otázce, která tkáň by měla být vyšetřována. V zásadě je vhodná ta tkáň, která je klinicky postižena. Jsou-li postiženy kosterní svaly, je vhodným vyšetřovaným materiálem mikrobiopsie deltoideu. Je-li postižen hematopoetický systém (např. u Pearsonova syndromu), vyšetření by mělo být provedeno v cirkulujících lymfocytech, polymorfonukleárních buňkách nebo v kostní dřeni. Je-li však choroba vyjádřena hlavně v játrech nebo srdci, je získání přístupu k cílové tkáni mnohem méně jednoduché. Přesto je obvykle možná jehlová biopsie jater nebo endomyokardiální biopsie. Pokud ne, nebo je-li choroba vyjádřena hlavně v obtížně dostupném orgánu (mozek, sítnice, endokrinní systém, hladké svaly), měly by být důkladně vyšetřeny periferní tkáně (včetně kosterních svalů, kultivovaných kožních fibroblastů a cirkulujících lymfocytů). Ať už je postižen jakýkoliv orgán, je u každého takového pacienta zásadní provedení kožní biopsie (i post mortem) pro následné vyšetření v kultivovaných fibroblastech.

Mělo by však být jasné, že in vitro vyšetření oxidativní fosforylace je obtížné bez ohledu na vyšetřovanou tkáň. Měla by být zvažována tato úskalí :

  • Normální enzymatická aktivita respiračního enzymu nevylučuje mitochondriální dysfunkci ani v tkáni s klinickými projevy onemocnění. Je nutné se zabývat kinetickými variantami, tkáňovou heterogenitou nebo buněčným mozaicismem (heteroplazmie, viz dále). V tomto případě by měly být provedeny rozsáhlé molekulárně genetické analýzy jiných tkání a (možná) opakování vyšetření později.
  • Kromě zjevně špatné diagnostiky (např. záměna Pearsonova syndromu za Schwachmanův syndrom) a falešně pozitivních nálezů deficitu respiračních enzymů (obvykle v neexpertních centrech), jsme si vědomi skutečného sekundárního enzymatického deficitu u řady chorob:
  1. ostatní dědičné metabolické poruchy, zejména propionová acidémie, poruchy cyklu TCA (deficit fumarázy), poruchy oxidace mastných kyselin (deficit acyl-CoA a 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin s dlouhým řetězcem) a deficit mevalonátkinázy;
  2. primární poruchy centrálního nervového systému (CNS), zvláště Friedreichova ataxie, kde ionty železa způsobují poškození respiračního řetězce vazbou iontů železa a síry, zprostředkovanou volnými radikály;
  3. chromozomální mikrodelece, které porušují stechiometrii respiračního řetězce (např. delece 1p36, delece 5q v genu NSD1 u Sotosova syndromu).
  • Rozpoznání enzymatických deficitů někdy brání rozložení kontrolních hodnot, neboť normální hodnoty často zasahují do hodnot zjišťovaných u pacientů. Je vhodné vyjadřovat výsledky jako poměry, zvláště když normální funkce respiračního řetězce vyžaduje konstantní poměr enzymatických aktivit. Za těchto podmínek mohou být pacienti, u nichž jsou absolutní hodnoty aktivit v nižším normálním rozmezí, diagnostikováni jako pacienti s enzymatickým deficitem, a při hodnocení výsledku nemusí být rozpoznány generalizované poruchy oxidativní fosforylace.
  • V současnosti není dostupná žádná spolehlivá metoda k ověření aktivity komplexu I v cirkulujících nebo kultivovaných buňkách, neboť oxidace NADH-generujících substrátů kontrolními buňkami, ošetřenými detergentem nebo rozmrazenými, je variabilní, a aktivita rotenon-rezistentní NADH cytochrom C reduktázy je v těchto tkáních vysoká.
  • Fenotypová exprese deficitů respiračních enzymů v kultivovaných buňkách je nestabilní a aktivity se vracejí k normálním hodnotám, pokud buňky rostou ve standardním médiu. Přidání uridinu (200 mmol/l) do kultivačního média vyloučí početní selekci buněk s deficitem respiračních enzymů a umožní jim normálně růst, a tak stabilizovat mutovaný fenotyp (uridin, který je potřebný pro syntézu nukleových kyselin, je pravděpodobně limitován sekundárním deficitem dihydroorotátdehydrogenázové aktivity závislé na respiračním řetězci).
  • Diskrepance mezi hodnotami kontrol mohou znamenat chybné experimentální podmínky. Aktivity závislé na jednom substrátu by měly být shodné, nejsou-li stanovovány za limitujících podmínek. Například normální aktivita sukcinát cytochrom C reduktázy by měla být 2x vyšší, než normální aktivita sukcinát chinondichlorofenol (DCPIP) reduktázy (neboť k redukci cytochromu C je potřebný jeden elektron, kdežto k redukci DCPIP jsou potřebné dva elektrony).
  • Nesprávné zamražení může vést k rychlému poklesu chinon-dependentních aktivit, pravděpodobně kvůli peroxidaci membránových lipidů. Vzorky tkání fixované pro morfologické studie nejsou vhodné pro současné vyšetřování respiračních enzymů.
Histopatologické studie

Hlavním histopatologickým projevem mitochondriální myopatie jsou red-ragged fibers (RRF), které se prokazují použitím modifikovaného barvení Gomoriho trichromem a představují periferní a intermyofibrilární hromadění abnormálních mitochondrií. I když diagnostický význam patologických studií je nepochybný, nepřítomnost RRF nevylučuje diagnózu mitochondriální poruchy. K analýze distribuce mitochondrií v jednotlivých buňkách a k hodnocení přítomnosti nebo absence enzymatických aktivit jsou pro oxidativní enzymy používána různá histochemická barvení. Histochemické barvení umožňuje odhalit závažnost a heterogenitu enzymatického deficitu ve stejné části svalu. Myofibrilární integrita, dominující typ vláken a jejich distribuce mohou být hodnoceny barvením s myofibrilární adenosintrifosfatázou. Ve specializovaných centrech se provádějí studie s použitím polyklonálních a monoklonálních protilátek, zaměřených proti podjednotkám COX. Pro analýzu musí být vzorek svalu, odebraný v lokální anestezii, okamžitě zamražen v tekutém, dusíkem chlazeném izopentanu.

Magnetická rezonanční spektroskopie svalu a mozku

Magnetická rezonanční spektroskopie (MRS) umožňuje in vivo studium energetického metabolismu ve svalu a mozku. Mohou být měřeny koncentrace laktátu, anorganického fosfátu (Pi), fosfokreatininu (PCr) a intracelulární pH. Poměr Pi/PCr je nejvhodnějším parametrem, může být monitorován v klidu, během cvičení a během odpočinku po cvičení. U většiny pacientů nacházíme zvýšený poměr, a MRS se tak stává užitečným nástrojem při diagnostice mitochondriálních onemocnění a při monitorování léčebných studií. Pozorované odchylky však nejsou specifické pro deficity respiračních enzymů a nemůže být provedena korelace mezi nálezy MRS a místem deficitu respiračního enzymu.


Autor: Redakce


Literatura:
Fernandes, J., Saudubray, J.M., Berghe, G., Walter, J. Diagnostika a léčba dědičných metabolických poruch. Praha: Triton 2008

Design and code by webmaster